CRISPR-Cas12a“看见”宠物呼吸道病原体的40分钟 ——南昌大学团队构建4Ts恒温核酸快检平台，推动分子诊断下沉家庭场景

  近年来，CRISPR技术因其高特异性和可编程性，成为分子诊断领域的热门方向。然而，把这项技术从专业实验室“搬”到普通家庭，仍面临反应步骤多、设备依赖强、结果判读难等挑战。南昌大学一支实践团队通过整合恒温扩增、CRISPR识别与试纸条可视化，构建出适用于宠物呼吸道病原体居家快检的“4Ts”平台，将检测全流程压缩至约40分钟。

  PCR“下岗”？恒温扩增让检测告别昂贵热循环仪

  传统PCR核酸检测依赖反复升降温的热循环仪，对电源、空间和操作人员都有较高要求。为适配家庭场景，团队选择RT-TSA等温扩增技术：在37℃左右的恒定温度下，引物与模板结合后即可实现核酸指数级扩增。这意味着，整个反应不再需要精密温控设备，普通恒温模块即可完成，从源头降低了设备成本和体积。

  图3 团队开展恒温扩增引物与crRNA候选序列筛选（团队供图）

  “引物和crRNA的筛选是关键第一步。”团队介绍，他们针对猫杯状病毒、疱疹病毒、支原体等宠物常见呼吸道病原，设计了多组恒温扩增引物，并筛选出信号强、特异性好的crRNA序列。荧光曲线和凝胶电泳结果显示，优化后的引物与crRNA组合可在20分钟内产生明显的扩增与切割信号，为后续试纸显色判读奠定了基础。

  Cas12a“剪刀”+试纸条“显色”：把分子信号变成肉眼可见

  在CRISPR-Cas12a系统中，一旦crRNA识别到目标病原核酸序列，Cas12a蛋白就会被激活，进而无差别切割体系中的单链DNA报告探针。团队巧妙利用这一“反式切割”活性，在报告探针上分别标记荧光基团FAM和生物素Biotin：切割后，试纸条的质控线（C线）捕获完整探针，检测线（T线）捕获被切割的报告片段。两条线同时显色即为阳性，仅C线显色则为阴性。

  “相比于需要专门仪器的荧光读数，试纸条判读对用户更友好。”团队成员解释道。毛细层析作用驱动液体在试纸条上迁移，5至10分钟即可完成显色，既保留了CRISPR技术的高特异性，又继承了胶体金试纸“肉眼可读”的便捷性。

  4Ts平台：把三步反应“装”进一套装置

  团队将“样本裂解—恒温扩增—CRISPR检测—试纸显色”四个核心环节整合为4Ts平台，并据此设计出便携式检测装置：装置上部设有A仓，用于RT-TSA恒温扩增；B仓为CRISPR检测与横向侧流试纸显色区；侧面留有采样口和可视化观察窗。用户按照“加样—按键—等待—读条”四步操作，即可完成从样本到结果的完整流程。

  图4 基于4Ts系统的便携式检测装置设计（团队供图）

  在特异性验证中，团队用SARS-CoV、流感病毒A型、流感病毒B型、流感病毒C型和SARS-CoV-2等呼吸道病原进行交叉反应测试。结果显示，仅目标病原样本呈现阳性条带，其余病原均为阴性，证明该体系具备良好的分析特异性。同时，检测灵敏度可达到10 copies/μL量级，足以满足早期感染筛查需求。

  从单一病原到多病源：家庭场景或成下一站

  目前，团队已围绕该平台开展猫杯状病毒、疱疹病毒、支原体、衣原体、犬瘟热病毒等宠物常见病原的检测方法开发。未来，他们计划通过更换不同的crRNA和引物组合，使同一套4Ts平台能够覆盖更多病原，实现“一次采样、多病源筛查”。

  “我们真正想做的是把实验室级的分子诊断能力，变成每个养宠家庭都能随时调用的健康工具。”团队表示，接下来将持续优化试剂稳定性、装置成本和用户体验，并推动相关检测流程的标准化与产品化验证，让“在家测核酸”从设想走向现实。（刘翼萱 张译文 尹怡祺）